聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)的操作與維護指南

　　聚乙烯亞胺PEI-Pro（GMP）是一種GMP級別的轉染試劑，其操作與維護指南主要包括以下內容：

　　一、操作指南

　　1.貼壁細胞轉染操作

　　以6孔板轉染293T細胞為例：

　　轉染前準備：

　　轉染前一天：用膠原酶消化細胞并計數（不建議用胰酶）。按照每孔2×10^6的細胞量接種293T至6孔板（每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS培養基和1ml的細胞懸液），置于37°C、5%CO2培養箱培養24小時。

　　24小時后，移除之前培養基，每孔加入2ml新鮮的DMEM:F12+5%FBS。注意確保293T細胞生長狀態良好，傳代不超過15代。

　　第一天：顯微鏡下檢查細胞匯合度，當細胞達到70%到80%的匯合度時，開始準備轉染。

　　轉染步驟：

　　對于每孔細胞，用100μl無血清培養基（如OPTI-MEMⅠ培養基）稀釋DNA，使DNA終濃度為1ug/ml（DNA/總培養體積）。

　　對于每孔細胞，用100μl無血清培養基（如OPTI-MEMⅠ培養基）稀釋適當比例的適量BIOHUB-PRO GMP。DNA與BIOHUB-PRO GMP的比例要根據實驗摸索最適比例。

　　將稀釋的BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中（總體積200μL），輕輕混勻，室溫孵育30分鐘。

　　小心地將BIOHUB-PRO GMP復合物滴加到細胞培養板每個孔中，輕輕搖動培養板混勻。注意加入混合液時輕輕沿著孔板邊緣滴入，避免破壞細胞的粘附性。

　　將培養板放入37°C、5%CO2培養箱中培養24小時。

　　觀察轉染結果：

　　第二天：在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，通常超過80%的293T細胞在轉染后的24小時可以觀察到綠色熒光。

　　2.懸浮細胞轉染操作

　　以293F細胞于100mL培養瓶（溶液體積占瓶體積的1/5）操作體系為例：

　　細胞培養：

　　HEK293F細胞傳代接種于20mL懸浮細胞生長培養基中，在36.5℃、120rpm、5%CO2的條件下培養。當細胞密度達到1×10^6cells/mL時，旋緊瓶口放入搖床繼續培養，2~4小時后可以進行轉染。

　　轉染步驟：

　　用1mlOptiPRO?SFM（無血清培養基）稀釋適量的DNA，使DNA終濃度為1ug/ml（DNA/總培養體積）。混勻并靜置5分鐘。

　　用1mlOptiPRO?SFM（無血清培養基）稀釋適當比例的BIOHUB-PRO GMP，混勻并靜置10分鐘。

　　將BIOHUB-PRO GMP轉染試劑加入到稀釋的質粒中，輕輕混勻，室溫孵育30分鐘。

　　將BIOHUB-PRO GMP轉染復合物逐滴加入到細胞培養液中，搖勻后旋緊瓶口放回搖床（36.5℃、5%CO2、120rpm）。

　　基因表達檢測：

　　基因表達可在24~72小時后檢測，具體時間取決于細胞系和轉基因。
 

　　二、維護指南

　　1.儲存條件

　　PEI-Pro（GMP）轉染試劑建議儲存在低溫環境中，如4℃冰箱或-20℃冰凍條件下。低溫環境能夠有效延緩PEI分子結構的降解，保持其穩定性。

　　避免PEI溶液的反復凍融，以保持其最佳狀態。

　　2.使用注意事項

　　PEI-Pro（GMP）轉染試劑的使用濃度是實驗效果的關鍵因素之一。一般建議將PEI溶液稀釋至適合的工作濃度后立即使用，避免長時間儲存稀釋后的溶液。

　　不同的細胞類型對PEI濃度的敏感度不同，實驗人員應根據具體細胞的需求進行優化，以提高轉染效率。

　　若發現PEI溶液出現沉淀、渾濁或顏色變化，可能意味著其已發生降解，建議此時更換新的試劑，以確保實驗結果的準確性。

　　3.定期驗證

　　長期保存的PEI-Pro（GMP）轉染試劑在使用前應進行小規模實驗驗證其轉染效率是否依然符合要求，這樣可以避免浪費實驗材料和時間。

　　4.更新與替換

　　對于經常需要使用PEI-Pro（GMP）轉染試劑的實驗室，建議定期更新儲存的試劑，并按照生產商的建議進行正確的儲存和使用。

　　通過以上操作與維護指南，可以確保聚乙烯亞胺PEI-Pro（GMP）轉染試劑在細胞轉染實驗中的有效性和穩定性，提高實驗結果的準確性和可重復性。