簡要介紹熒光染料的應(yīng)用

熒光染料在吸收紫外線或可見光后，能把短波長的光轉(zhuǎn)變?yōu)椴ㄩL較長的可見光波而反射出來，呈閃亮的鮮艷色彩。泛指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光的光波的物質(zhì)。它們大多是含有苯環(huán)或雜環(huán)并帶有共軛雙鍵的化合物。

工業(yè)應(yīng)用：熒光染料可用作洗衣粉中的增白劑、各種熒光路標(biāo)漆等熒光染料產(chǎn)品的制備。此外還用于纖維織物印染和某些特殊標(biāo)志的制作。

科研應(yīng)用：熒光染料在科研中常用于熒光免疫、熒光探針、細(xì)胞染色等。包括特異性的DNA染色，用于染色體分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復(fù)染劑，可作為背景對照，標(biāo)記細(xì)胞核使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。

在免疫分析中熒光標(biāo)記的單克隆抗體技術(shù)為流式細(xì)胞儀在研究細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)各種功能性抗原、腫瘤基因蛋白等領(lǐng)域擴(kuò)展了無限的應(yīng)用空間。熒光探針可以通過蛋白質(zhì)交聯(lián)劑共價結(jié)合在單克隆抗體上。

在核酸檢測中熒光染料對細(xì)胞核染色后定量測量細(xì)胞所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，就可以確定細(xì)胞核中DNA、RNA的含量，并可以對細(xì)胞周期和細(xì)胞的增殖狀況進(jìn)行分析。有多種熒光染料可以對細(xì)胞中的DNA或RNA染色，常用的DNA染料包括碘化丙啶(PI)、DAPI、Hoechst 33342等，RNA染料有噻唑橙、吖啶橙等。

常用熒光染料：

（一）免疫熒光標(biāo)記常用的熒光染料

FITC（異硫氰酸熒光素）：綠色530nm

PE（藻紅蛋白）：橙黃色575nm

PerCP（多甲藻黃素葉綠素蛋白）：深紅色675nm

PI（碘化丙啶）：橙紅色620nm488nm波長的氬離子激光激發(fā)

APC（別藻青蛋白）：紅色660nm630nm波長的氦氖激光或紅色二極管激光激發(fā)

Cy3：激發(fā)波長488nm，最大發(fā)射波長570nm。

1）其標(biāo)記的抗體適用于所有配備488nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；

2）FL2通道檢測；

3）為小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細(xì)胞術(shù)，熒光強(qiáng)度低于PE。

Cy5：激發(fā)波長633/635nm，最大發(fā)射波長670nm。

1）其標(biāo)記的抗體適用于所有配備633nm氬離子激光器的流式細(xì)胞儀；

2）FL4通道檢測；

3）小分子染料，非常適合需小分子染料的流式細(xì)胞術(shù)，熒光強(qiáng)度低于APC。

4）與單核和粒細(xì)胞非特異性結(jié)合多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

（二）免疫熒光標(biāo)記

常用的標(biāo)記染色為直接免疫熒光染色和間接免疫熒光染色。在進(jìn)行雙參數(shù)或多參數(shù)分析時，常常需要進(jìn)行熒光抗體的組合標(biāo)記，目前已經(jīng)有雙色、三色以及四色標(biāo)記。

（三）細(xì)胞自發(fā)熒光

自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關(guān)鍵。一般說來，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（例如核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞／活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。